Меню

Бактериологическая диагностика менингококковой инфекции

Схема 16. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Микроскопический метод. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя и обнаружении внутри лейкоцитов грамотрицательных диплокок­ков в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой

стороной друг к другу, позволяет сделать положительное заключение о наличии у пациента менингококковой инфекции (рис. 22).

Рис. 22. Менингококк(Neisseria meningitides) в спинно-мозговой жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом (а) и в чистой культуре (б). Окраска по Граму. х630

Микроскопическое исследование мазков из носоглотки бактерионосителей дает возможность выявить наряду с менингококком стафилококки, стрептококки и непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.), дифференциро­вать которые по морфологическим и тинкториальным свойствам практически невозможно.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают петлей на чашки с сывороточным МПА, содержащим антибиотики (ристомицин, ванкомицин, колистин и ниста-

тин) для подавления роста сопутствующей микрофлоры (преимущественно кокков). Асцитическая жидкость в качестве добавки к питательным средам в настоящее время не

применяется, так как в результате лечения больных в ней накапливаются вещества, ингибирующие рост микроорганизмов (в том числе менингококка). Ме­нингококк на сывороточном МПА вырастает при температуре 37 0 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (используют СО2 инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой) через 48 часов, колонии величиной с булавочную головку, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями. В мазках из чистой культуры менингококка (рис.21) микрокартина иная (полиморфные дипло- и тетракокки), чем в мазках из спинно-мозговой жидкости.

Типичные для менингококка колонии пере­севают в пробирку со скошенным сывороточным МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию чистой культуры менингококка, ее дифференциацию от сап­рофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 18).

Таблица 18.Основные биологические свойства нейссерий

Свойства Виды нейссерий
N.meningitidis N.subflava N.flava N.mucosa N.sicca
Рост на МПА + + + +
Потребность в СО2 +
Желтый пигмент + + ± ±
Ферментация: глюкозы мальтозы сахарозы фруктозы лактозы К+ К+ — — — К+ К+ К± К± — — — — — — К+ К+ К+ К+ — К+ К+ К+ К+ —
Образование полисахарида из сахарозы ± + + +
Нитратредуктаза +
РА с менингококковыми сыворотками сероваров А., В, С +

Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, (±) – непостоянный признак, К – образование кислоты

Специфичес­кий полисахаридный менингококковый антиген можно выявить в спинномозговой жидкости с помощью метода встречного иммуноэлектрофореза в геле. С этой целью в агаровом геле на стеклянных пластин­ках, размером 9×12 см, вырезают два параллельных ряда лунок диаметром 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемый ликвор, в лунки другого — преципитирующие сыворотки против менингококков разных серогрупп. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40-45 мин при комнатной температуре. Положительный результат характеризуется появлением 1-2 полосок преципитации между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой.

Генодиагностика. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР, что дает основание в случае получения положительного результата поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Для ретроспективного подтверждения диа­гноза используют РНГА с парными сыворотками.

Экспресс-методы диагностики.Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют ИФМ, а также непрямую латекс-агглютина­цию и РНГА с антительными диагностикумами.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Изучение морфологии менинго­кокка в мазках из ликвора больного с подозрением на менингококковую инфекцию (демонстрация). Типично наличие грамотрицательных диплококков, располагающихся внутри лейко­цитов.

2. Бактериологический метод. Учет культуральных свойств менингококка на сывороточном МПА с ристомицином. Колонии ме­нингококков прозрачные с голубым оттенком, ровные, мелкие (с булавочную головку). Изучить биохимические свойства менингококка в соответствии с таблицей .

3. Учесть демонстрационную РНГАс парными сыворотками больного (7 и 14 дни болезни) с подозрением на менингококковую инфекцию.

4. Биопрепараты для диагностики и профилактики менингококковой инфекции:

· отечественная химическая вакцина полисахаридная менингококковая вакцина групп А и С. Применяется по эпидемиологическим показаниям. В России зарегистрирована также кубинская В+С менингококковая вакцина, состоящая из белков менингококков группы В и полисахаридов менингококка группы С, а также полисахаридная вакцина МенингоА+С фирмы Пастер Мерье Коннот;

· агглютинирующие и преципитирующие сыворотки против менингококка, применяются с диагностической целью для постановки РА с целью серологического типирования менингококка и встречного иммуноэлектрофореза для обнаружения менингококкового антигена в спинно-мозговой жидкости.

· эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы для обнаружения антигенов менингококка в спинномозговой жидкости с помощью РНГА.

Источник

Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов Текст научной статьи по специальности « Ветеринарные науки»

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Краева Людмила Александровна

Резюме. В обзоре представлены современные сведения о таксономии, биологических особенностях и клиническом значении возбудителей менингококковой инфекции и бактериальных гнойных менингитов. Изложены методы лабораторной диагностики и рекомендации по использованию высококачественных сред и диагностических наборов для выращивания и идентификации микроорганизмов. Предложены современные методики определения их чувствительности к антибиотикам.Abstract.

Похожие книги на litres.ru

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Краева Людмила Александровна

In the review modern data on taxonomy, biological features and clinical significance of agent of meningococcal infection and bacterial purulent meningitis are presented. Methods of laboratory diagnostics as well as recommendations about use of high-quality culture media and diagnostic kits for isolation and identification of microorganisms are described. Modern techniques to detect sensitivity of bacteria to antibiotics are proposed.

Текст научной работы на тему «Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов»

Инфекция и иммунитет 2011, Т. 1, № 1, с. 51-58

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ

ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург

Резюме. В обзоре представлены современные сведения о таксономии, биологических особенностях и клиническом значении возбудителей менингококковой инфекции и бактериальных гнойных менингитов. Изложены методы лабораторной диагностики и рекомендации по использованию высококачественных сред и диагностических наборов для выращивания и идентификации микроорганизмов. Предложены современные методики определения их чувствительности к антибиотикам.

Ключевые слова: менингококковая инфекция, бактериальный гнойный менингит, N. meningitidis, H. influenzaе, S. pneumonia.

microbiological diagnostics of the meningococcal infection and purulent bacterial meningitis

Abstract. In the review modern data on taxonomy, biological features and clinical significance of agent of meningococcal infection and bacterial purulent meningitis are presented. Methods of laboratory diagnostics as well as recommendations about use of high-quality culture media and diagnostic kits for isolation and identification of microorganisms are described. Modern techniques to detect sensitivity of bacteria to antibiotics are proposed. (Infekcid i immunitet, 2011, vol. 1, N1, p. 51—58)

Keywords: meningococcal infection, bacterial purulent meningitis, N. meningitidis, H. influenzaе, S. pneumonia.

Менингококковая инфекция — инфекционное заболевание, проявляющееся различными клиническими формами и вызываемое менингококком (Neisseria meningitidis). Основной формой инфекции является носительство. У части зараженных людей размножение бактерий в носоглотке приводит к местным воспалительным реакциям (назофарингит). У другой части зараженных наблюдаются генерализованные формы менингококковой инфекции (ГФМИ). При этом возбудитель гематогенно проникает в различные органы, чаще — в центральную нервную систему (ЦНС), вызывая поражение мозговых оболочек (менингококковый ме-

нингит) и, реже, мозговой ткани (энцефалит). Встречаются общетоксические формы, сопровождающиеся поражением многих тканей, включая токсические поражения надпочечников, и циркуляцией менингококка в крови (менингококкцемия).

Читайте также:  Диагностика познавательных ууд в начальной школе по фгос

Менингит — это инфекционное заболевание с преимущественным поражением мягкой мозговой оболочки головного и спинного мозга. Характерные для этого заболевания тяжелые клинические проявления и генерализация процесса с поражением различных органов и тканей требуют быстрого решения вопроса об этиологии заболевания и назначения адек-

поступила в редакцию 11.11.2010 отправлена на доработку 15.11.2010 принята к печати 19.11.2010

Адрес для переписки:

Краева Людмила Александровна, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории бактериальных капельных инфекций ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора. Тел.: (812) 498-09-39 (служебн.). E-mail: tsenevapasteur@yandex.ru

ватной антибактериальной терапии, которая неоднозначна для гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) разной этиологии.

От грамотного и своевременного проведения исследований по определению этиологического агента заболевания и как можно более раннего начала соответствующего этиотроп-ного лечения зависит исход заболевания, показатели летальности, число и тяжесть постинфекционных осложнений. Известно, что одним из проявлений ГФМИ является распространенная клиническая форма «менинго-кокковый менингит» без менингококкцемии. В этом случае точный клинический диагноз без проведения лабораторных исследований поставить невозможно. Поэтому так важна своевременная и правильная микробиологическая диагностика.

Как в случае менингококковой инфекции, так и в случае бактериальных гнойных менингитов, лабораторным критерием является выделение микроорганизмов из стерильных в норме мест.

Менингококковая инфекция занимает важное место в инфекционной патологии, что обусловлено следующим:

• тяжестью течения и высокой летальностью, достигающей 5—10% при генерализованных формах болезни;

• бурным развитием болезни и необходимостью ранней диагностики и оказания экстренной терапевтической помощи;

• многообразием нозологических форм, с которыми необходимо проводить дифференциальную диагностику;

• возможностью неблагоприятных отдаленных последствий.

Менингит был известен в глубокой древности. Впервые клиническая картина менингита была описана античными врачами Аретеем и Павлом Эгинским, однако первое описание эпидемического цереброспинального менингита как самостоятельной нозологической формы дал в 1805 г. Вьессе (Viesseux) во время вспышки этой болезни в Женеве. В дальнейшем заболевания менингитом были зарегистрированы в США, Франции, Испании, Скандинавских странах. Первые вспышки менингита в России были отмечены в 1863—1864 гг. Менингококк был открыт и выделен в чистой культуре Век-сельбаумом в 1887 г. Морфология менингококка была описана в 1907 г. Флекснером.

Возбудитель менингококковой инфекции — Neisseria meningitidis, принадлежит к семейству Neisseriaceae рода Neisseria [10]. Для человека имеют клиническое значение следующие виды нейссерий: N. meningitidis, N. gonorrhoeae (с подвидом kochii), N. lactamica, N. sicca, N. subflava (биовары subflava, flava, perflava), N. mucosa, N. flavescens, N. cinerea, N. polysaccharea, N. elongate

(подвиды elongata, glycolytica, nitroreducens). Несколько видов нейссерий являются частью нормальной флоры респираторного тракта у собак: N. canis, N. weaver. В респираторном тракте морских свинок обитает N. denitrificans. Из ротовой полости резус-макак, коров и пресмыкающихся выделяли: N. macacae, N. dentiae, N. iguana [13, 16, 17].

Однако к развитию менингококковой инфекции причастна именно N. meningitidis. Клинический спектр менингококковых инфекций разнообразен:

— менингит (с/без менингококкцемии);

— менингококкцемия без менингита;

— бактериемия без септического осложнения;

— остеомиелит, артрит, эндофтальмит, спонтанный перитонит и др., являющиеся результатом гематогенного распространения N. meningitidis;

— различные воспалительные процессы урогенитального тракта, когда особенно важна дифференциация N. meningitidis от N. gonorrhoeae.

Морфологически менингококк — округлый, неподвижный, грамотрицательный бобовидный диплококк диаметром 0,6—0,8 мкм (рис. 1б, III обложка). Трехслойная оболочка клетки представлена цитоплазматической мембраной, пептидогликановым слоем и наружной мембраной, содержащей ЛПС и белки (рис. 1в, III обложка). Многие менингококки имеют по-лисахаридную капсулу и выросты, известные как пили [3, 5, 6, 9, 15]. Менингококки по серологической активности, которая определяется капсульным полисахаридом, внутри вида делятся на серогруппы. Известно 13 серогрупп менингококков: А, В, С, D, H, I, K, L, X, Y, Z, W-135, 29E, но только три из них — А, В, С — ответственны за более чем 90% всех генерализованных форм менингококковой инфекции. Внутри отдельных серогрупп также обнаруживается антигенная неоднородность по белкам наружной мембраны, которые определяют серо- и субтип возбудителя. К настоящему времени известно более 20 серотипов менингококка, из них типы 2, 4, 10, 15, 16 оценены как маркеры вирулентности, так как менингококки с такими серотипами выявлялись преимущественно в период подъема заболеваемости или при вспышках.

Менингококки, кроме того, имеют общие, главным образом белковые, антигенные компоненты со многими непатогенными нейссе-риями, постоянно обнаруживаемыми в носоглотке, в том числе с N. lactamica, которая часто вегетирует в носоглотке детей раннего возраста, особенно грудных младенцев.

Циркуляция среди населения различных групп менингококков и непатогенных нейссе-рий создает у людей целую гамму устойчивости к различным агентам и определяет ряд особенностей развития эпидемического процесса.

Результаты изучения антигенной структуры менингококков позволили разработать проспективную номенклатуру, которая имеет следующий вид: серогруппа : серотип по белку : субтип по белку : серотип по ЛПС. Например, В : 2а : Р 1,2 : L 3,7, что означает: штамм менингококка серогруппы В, серотипа 2а, субтипа 1,2, серотипа по ЛПС 3,7. Соответствующие современные классификации менингококков по различным антигенным системам позволяют определять их популяционные особенности и отбирать наиболее иммуногенные компоненты для конструирования вакцинных препаратов нового поколения.

Основной фактор патогенности менингококка — бактериальная капсула, защищающая менингококки от различных воздействий, в первую очередь от поглощения фагоцитами. АТ, образующиеся к полисахаридам капсулы, проявляют бактерицидные свойства.

Токсические проявления менингококковой инфекции обусловлены липополисахаридами, сходными по химическим и биологическим свойствам с эндотоксинами энтеробактерий. Им принадлежит ведущая роль в патогенезе поражений сосудов и кровоизлияний во внутренние органы. Наиболее постоянный и диагностически значимый признак менингококцемии — экзантема в виде характерной геморрагической сыпи (петехии, пурпура, экхимозы).

В процессе метаболизма менингококк гибнет, освобождая эндотоксин, который является мощным нейротропным и сосудистым ядом, который, как и сам возбудитель, усиливает продукцию спинномозговой жидкости, чем и обусловлено развитие гипертензионного синдрома, который усугубляется изменением качественного состава ликвора.

Пили являются фактором адгезии к слизистой оболочке носоглотки и тканям мозговой оболочки.

Менингококки выделяют ^А-протеазы, расщепляющие молекулы ^А в шарнирной области, что защищает бактерии от действия

Менингококковая инфекция — строгий ан-тропоноз. Различают три категории источников менингококковой инфекции: больные генерализованными формами; больные назофарин-гитом; носители.

Входные ворота при менингококковой инфекции — преимущественно носоглотка. В большинстве случаев заболевание протекает субклинически (менингококконосительство). Воспалительный процесс в месте внедрения (острый назофарингит) сопровождается яркой

гиперемией и отечностью задней стенки глотки на фоне почти неизмененных небных дужек, миндалин и мягкого неба. Основной путь распространения в организме — гематогенный. Менингококковую бактериемию сопровождает массовая гибель возбудителей и выделение эндотоксина (менингококкцемия). Генерализация наиболее часто связана с предшествующими респираторными инфекциями (особенно вирусными), нарушениями иммунного статуса, а также резкой сменой климатических условий. Патогенез заболевания включает поражения токсического и септического характера в сочетании с аллергическими реакциями. Преобладание того или иного компонента проявляется в различных клинических формах, подробно описанных в соответствующей литературе [2, 4, 11, 12].

Менингококк малоустойчив к воздействию факторов внешней среды, требователен к условиям культивирования. Температурный оптимум для него 36,5—37°С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5—10%) и влажности, чрезвычайно чувствителен к воздействию внешней среды. Менингококки нуждаются в высокопитательных средах, содержащих нативные белки или кровь животного происхождения. При росте на плотных питательных средах образуют небольшие, слегка выпуклые, полупрозрачные колонии с идеально ровными краями. При выдерживании посевов в термостате в течение 2—5 дней колонии увеличиваются в размере, становятся менее прозрачными и края их приобретают неровный вид. Биохимическая активность менингококков невелика и из числа многих углеводов они ферментируют только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты без газа, не разжижают желатин, оксидазо- и ката-лазоположительны.

Читайте также:  Лаборатория пцр диагностики большая грузинская

Бактериальные гнойные менингиты — группа инфекционных заболеваний нервной системы, характеризующихся развитием общеинфекционного, общемозгового, менингеального синдромов и воспалительными изменениями в цереброспинальной жидкости гнойного характера [2, 12].

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире регистрируется 1 млн случаев гнойных бактериальных менингитов, из которых 200 тыс. заканчиваются летально.

Гнойные бактериальные менингиты могут вызывать следующие микроорганизмы: N. meningitidis, H. influenza, S. pneumonia, Acineto-bacter, Actinobacillus, Aeromonas, B. dermatitidis, B. zoohelcum, Bacillus, Balneatrix, Borrelia, C. burnetii, Campylobacter, Capnocytophaga, CDC group lie, Citrobacter, Coccidioides, Commamonas, E. coli, E. me-

ningoseptica, Enterobacteriaceae, Gemella, Globicatella, Haemophilus spp., Listeria, M. luteus, M. tuberculosis, Moraxella, Mycoplasma, N. gonorrhoeae, nontuberculosis Mycobacterium, Ochrobactrum, P. aeruginosa, P. immo-bilis, Pasteurella, Ralstonia, Rhodococcus, Rhodotorula, Streptococcus spp, Tsukamurella, Vibrio [13, 16, 17].

Наиболее значимыми возбудителями признаны менингококки, пневмококки и гемо-фильные палочки типа «b», отвечающие за более чем 90% случаев от числа всех расшифрованных ГБМ. Среди гнойных бактериальных менингитов генерализованные формы менин-гококковой инфекции вызывают наибольшую озабоченность в мире из-за периодически возникающих пандемий, эпидемий, эпидемических подъемов заболеваемости и вспышек. Генерализованными формами менингококковой инфекции чаще болеют дети (до 70% от общего числа зарегистрированных случаев), при этом следует отметить возможность заражения ме-нингококковой инфекцией во всех возрастных категориях. Общий показатель летальности при ГФМИ определен как высокий и составляет в среднем 9—11%.

Таким образом, преимуществом в развитии менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов пользуется менингококк. Следующими по этиологической значимости в развитии гнойных бактериальных менингитов являются Haemophilus influenzae тип «b»(Hib) и Streptococcus pneumoniae (рис. 2, III обложка).

В этиологической структуре бактериальных менингитов среди детей Hib-возбудитель занимает второе место после менингококков. В отличие от других бактериальных менингитов Hib-менингиты встречаются почти исключительно среди детей раннего возраста: 80—95% Hib-менингитов приходится на возраст до 5 лет. Летальность составляет 3—6% и оценивается как высокая. В этой связи Hib-менингиты относят к категории опасных инфекционных заболеваний детского возраста.

Кроме Haemophilus influenzae важное клиническое значение имеют также такие виды как: H. aegyptius, H. haemolyticus, H. parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H. paraphrophilus, H. segnis, H. pittmaniae, H. para-phrohaemolyticus [10, 13, 16, 17].

Около 10% всей бактериальной микрофлоры ротоглотки человека, особенно в раннем детском возрасте, составляют гемофильные палочки. Одновременно могут выделяться несколько видов этих микроорганизмов, капсульные и бес-капсульные варианты. Передача наследственной информации, ответственной за проявление факторов патогенности, среди близкородственных микроорганизмов приводит к риску развития воспалительного процесса при длительном носительстве этих микробов. Наибольшему ри-

ску подвержены дети от 3 месяцев до 7 лет, особенно в возрасте 6—7 месяцев.

Менингиты пневмококковой этиологии занимают второе место в этиологической структуре бактериальных менингитов, уступая только генерализованным формам менингококковой инфекции. Они отличаются тяжелым и осложненным течением, часто требующим проведения интенсивных терапевтических и реанимационных мероприятий, высокими показателями летальности. Летальность среди детей до года и лиц пожилого возраста старше 65 лет достигает от 40 до 70%.

Резервуар пневмококковой инфекции — больные и носители. Уровень носительства максимален в организованных коллективах и достигает у детей 30—50%, у взрослых 20—30%. Основной путь передачи — контактный, при вспышках — воздушно-капельный.

В результате попадания пневмококков в кровоток и центральную нервную систему, возбудитель вызывает инвазивную инфекцию в виде бактериемии и менингита. Генерализация процесса обусловл ена низким уровнем специфического и неспецифического иммунитета и вирулентными свойствами возбудителя.

S. pneumoniae относится к группе грамполо-жительных кокков, к роду Streptococcus [3, 5, 6, 10, 15]. При анализе секвенированных фрагментов ДНК пневмококка было установлено, что на 99% S. pneumoniae идентичен S. mitis и S. oralis [13, 16, 17]. Поэтому внутри рода он относится к группе S. mitis. Встречаются как капсульные, так и бескапсульные штаммы. Основной фактор вирулентности пневмококка — капсула. По кап-сульным полисахаридам пневмококки разделены на 90 серотипов, имеющих различное эпидемиологическое значение. Из наиболее опасных серотипов приготовлены пневмококковые вакцины, использующиеся для вакцинации групп риска. В группы риска в первую очередь входят дети в возрасте до года и лица пожилого возраста старше 65 лет, лица, имеющие в анамнезе хронические заболевания сердца, легких, печени (особенно у больных алкоголизмом), почек, эндокринную патологию, сахарный диабет, гематологические, онкологические заболевания, черепно-мозговые травмы, ликворею, иммуно-дефициты различного генеза.

Методы лабораторной диагностики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов

Для получения правильного ответа в возможно короткие сроки необходимо сочетать как классические, так и экспресс-методы диагностики.

Бактериоскопический метод заключается в исследовании мазка центрифугата ликвора, окрашенного метиленовой синькой и по Граму в модификации Калины, а также толстой капли крови, окрашенной метиленовой синькой.

Бактериологический метод включает в себя выделение и идентификацию возбудителя до вида из различного клинического материала: крови, ликвора, мазка из носоглотки и т.д.

Серологический метод позволяет выявить:

• специфические антигены в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) Серологическое группирование менингококков является одной из мер эпидемиологического надзора за ме-нингококковой инфекцией;

• антитела в сыворотке крове при РНГА, когда берутся парные сыворотки при поступлении больного в стационар и на 10— 15 день болезни.

• ВИЭФ — метод встречного иммуноэлек-трофореза;

• НМФА — непрямой метод флюоресцирующих антител;

• латекс-агглютинация — особенно удобна при использовании наборов, сконструированных на основе моноклональных антител к основным возбудителям менин-гококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов (табл. 1);

• ИФА — метод иммуноферментного анализа;

• ПЦР — полимеразная цепная реакция, позволяющая выявить ДНК возбудителя.

При отборе и посеве исследуемого материала следует соблюдать следующие требования: исключить случайную контаминацию материала посторонней микрофлорой, не допустить гибели возбудителя с момента взятия материала для

анализа и до начала работы с ним в лаборатории, а также обеспечить безопасность сотрудников лаборатории при работе с вышеперечисленными инфекциями.

Спинномозговую жидкость отбирают у больного при пункции в объеме 2,0—5,0 мл на этапе поступлении в стационар до начала антибиотикотерапии с соблюдением правил асептики. У постели больного 0,5 мл засевают в чашку с «шоколадным» агаром, 0,5 мл ликвора засевают в среду обогащения (в 5,0 мл 0,1% полужидкого питательного агара с сывороткой крупного рогатого скота), предварительно вынутую из холодильника, и далее хранят при 37°С в условиях термостата до доставки в лабораторию. 1,0 мл направляют в лабораторию для бактериоскопии, серологических исследований и ПЦР.

Кровь отбирают из вены при поступлении больного в стационар с соблюдением правил асептики и до начала антибиотикотерапии. 5—10 мл крови взрослых, 2—5 мл — детей и 1—2 мл — новорожденных и детей неонатального периода засевают во флаконы с «двухфазной» питательной средой в соотношении крови к жидкой фазе 1 : 10 для уменьшения бактерицидного эффекта человеческой сыворотки. Двухфазная» питательная среда содержит X, V факторы роста и витамины. На ней хорошо растут менингококки, пневмококки, гемофильные палочки и другие менее требовательные к составу питательной среды микроорганизмы. Засеянную в отделении кровь доставляют в лабораторию и инкубируют в течение 5 суток при температуре 37°С. Посевы ежедневно просматривают на наличие микробного роста и делают высевы на плотные среды.

3—5 мл крови используют для серологических исследований с целью выявления специ-

таблица 1. наборы для латекс-агглютинации менингококков и основных возбудителей

гнойных бактериальных менингитов

Предназначение набора Название набора Производитель

Читайте также:  Техническая диагностика автомобилей лекции

Набор для латексной агглютинации стафилококков STAPHYTECT DRYSPOT Oxoid, Англия

Набор для латексной агглютинации стрептококков DRYSPOT PNEUMO Oxoid, Англия

Набор для латексной агглютинации стрептококков группы А STREPTOCOCCAL GROUPING REAGENT A Oxoid, Англия

Набор для латексной агглютинации Neisseria spp., Streptococcus spp., Haemophilus influenzae type b Latexes tests for the meningitis causing organisms from body fluids Oxoid, Англия

фических антигенов (встречный иммуноэлек-трофорез — ВИЭФ) и специфических антител (реакция непрямой гемагглютинации — РНГА). Для получения достоверных результатов о нарастании титров антител в РНГА важно исследовать парные сыворотки, т.е. сыворотки крови, взятые в первые дни болезни при поступлении больного в стационар и затем на 10—12 день заболевания.

Несколько капель крови наносят на предметное стекло для приготовления препарата «толстой капли» крови.

Посев носоглоточной слизи

Назофарингеальную слизь с задней стенки глотки берут натощак или через 3—4 часа после еды стерильным ватным тампоном. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка для наиболее полного открытия глоточного отверстия. Тампон вводят ватным концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2—3 раза по задней стенке. Посев выполняют немедленно после забора материала или после доставки материала в лабораторию на чашки с сывороточным агаром и на чашки с линкомицином.

Доставка и хранение материала

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляют в бактериологическую лабораторию немедленно после отбора в специальных контейнерах, способных поддерживать температуру 37°С. При невозможности быстрой доставки материала из отделения в лабораторию (ночное время, выходные и праздничные дни и др.) материал хранят следующим образом:

— посевы ликвора на первичной чашке с «шоколадным» агаром и в 0,1% полужидком питательном агаре, а так же посев крови на гемокуль-туру хранят в условиях термостата при 37°С;

— нативный ликвор и кровь для серологических исследований хранят в условиях холодильника при +4°С. В лаборатории нативный ликвор используют только для бактериоскопии и постановки серологических реакций. Для бактериологического посева хранящийся

в холодильнике нативный ликвор не используют.

Лабораторное подтверждение ГФМИ и выявление менингококков выполняют по следующим тестам:

• обнаружение в нативном материале диплококков с характерными морфологическими признаками;

• характерный рост только на высокопитательных средах;

• типичная морфология культурального мазка по Граму;

• сахаролитическая активность в отношении глюкозы и мальтозы;

• выявление группоспецифических свойств;

• обнаружение специфических антигенов в ликворе и/или сыворотке крови в реакциях латекс-агглютинации и ВИЭФ (экспресс-методы);

• детекция специфических антител в сыворотке крови в реакции РНГА.

Показания к лабораторной диагностике.

Лабораторное обследование проводят с диагностической целью, по эпидпоказаниям и с профилактической целью.

• С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (например, назофарингит) и с подозрением на менин-гококковую инфекцию и менингиты иной этиологии.

• По эпидпоказаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больным менингококко-вой инфекцией.

• С профилактической целью обследуют определенные здоровые контингенты с целью слежения за циркуляцией менингококка среди населения.

Основные этиологические агенты менин-гококковой инфекции и бактериальных гнойных менингитов очень требовательны к питательным средам, поэтому для их выделения необходимы специальные питательные среды, обогащенные ростовыми добавками (табл. 2).

таблица 2. питательные среды для выделения требовательных микроорганизмов

Питательная среда Название среды Производитель

Система Signal SIGNAL BLOOD CULTURE SYSTEM Oxoid, Англия

Среда для Haemophilus и селективная добавка Haemophilus test medium base Oxoid, Англия

Среда для Streptococcus и селективная добавка Edwards medium (modified) Oxoid, Англия

Схемы биохимического и серологического типирования подробно описаны в методических указаниях по менингококковой инфекции, в определителе бактерий Берджи и другой справочной литературе [8, 10, 17]. Поэтому в статье приведены лишь наборы биохимических тестов, сертифицированные в России и хорошо зарекомендовавшие себя при идентификации менингококков и основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов (табл. 3).

Методы определения лекарственной чувствительности.

1. Методы серийных разведений.

2. Диффузные методы:

2.1. диско-диффузионный (не желателен)

2.2. Е-тест (предпочтителен) (рис. 3, III обложка).

При определении чувствительности выделенных при менингококковой инфекции или бактериальных гнойных менингитах микроорганизмов необходимо руководствоваться следующими нормативными документми: МУК 4.2.1887-04 и МУК 4.12.1890-04 [7, 8].

В последние годы все чаще регистрируются случаи выделения при менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитах микроорганизмов, устойчивых ко многим используемым антибиотикам [1, 14]. Поэтому необходимы постоянные скрининговые исследования всех выделенных штаммов на чувствительность к антибиотикам как в фенотипиче-ских, так и в молекулярных тестах.

1. Воронина Л.Г., Блинова С.М. Антибиотикорези-стентность штаммов H. influenzae, выделенных в Екатеринбурге в 2000—2005 гг. у детей с различной локализацией // Журн. клин. микробиол. антимикроб. химиотер. — 2007. — Т. 9, № 2. — С. 187-192.

2. Королева И.С., Белошицкий Г.В. Менингококко-вая инфекция и гнойные бактериальные менингиты. — М.: Изд-во «Медицинское информационное агентство», 2007. — 112 с.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология. — СПб.: Специальная литература, 1998. — 580 с.

4. Лобзин Ю.В., Пилипенко В.В., Громыко Ю.Н. Менингиты и энцефалиты. — СПб.: Фолиант, 2006. — 128 с.

5. Маянский А.Н. Микробиология для врачей. — Н. Новгород: Изд-во НГМА, 1999. — 393 с.

6. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев. — М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. — 1200 с.

7. МУК 4.12.1890-04. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. — Москва, 2004.

8. МУК 4.2.1887-04. Лабораторная диагностика ме-нингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов: Методические указания. — Москва, 2004.

9. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией (в графическом изображении). — М.: Триада Х, 2002. — 347 с.

Предназначение набора Название набора Производитель

Набор для идентификации Neisseria, Moraxella, Haemophilus и родственных микроорганизмов RapID NH Panel 4hr ID of Neisseria, Moraxella, Haemophilus and related organisms Oxoid, Англия

Набор для идентификации коринебактерий API Coryne bioM6rieux

Набор для идентификации стрептококков API 20 Strep bioMerieux

Набор для идентификации Neisseria spp., Haemophilus spp. API NH bioM6rieux

Набор для идентификации Enterobacteriaceae и других грамотрицательных палочек API 20 E bioMerieux

Набор для идентификации стрептококков СТРЕПТОтест 16 Lachema

Набор для идентификации нейссерий НЕЙССЕРИЯтест Lachema

таблица 3. наборы для биохимической идентификации менингококков и основных

возбудителей гнойных бактериальных менингитов

10. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т.: пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита и др. — М.: Мир, 1997.

11. Резник Б.Я., Спалек С.Ф. Менингиты у детей. — М.: Медицина, 1971. — 226 с.

12. Сорокина М.Н., Иванова В.В., Скрипченко Н.В. Бактериальные менингиты у детей. — М.: Медицина, 2003. — 328 с.

13. A Manual Of Bacteriology / Ed. by H.U. Williams. — USA: Home Farm Books, 2008. — 480 p.

14. Daoud Z., Hanna N., Cjcjsaki A. Patterns of susceptibility of Streptococcus pneumonia and Haemophylus influenza at a university hospital //

Abstract of the 15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disease. — Geneva, 2005.

15. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schrecken-berger P.C. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. — 5th. ed. — N.Y.: Lippincott—Raven, 1977. — 1113 p.

16. Manual of Clinical Microbiology: 2 vol. set / Ed. by P.R. Murray, E.J. Baron, J. Jorgensen, M. Pfaller, M.L. Landry. — 9th ed. — USA, 2007. — 2476 p.

17. Microbiology Laboratory Manual / Ed. by J. P. Har-ley. — 7th ed. — USA: McGraw-Hill Higher Education, 2007. — 2256 p.

Источник

Adblock
detector