Меню

Биологический метод диагностики вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики — выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.

Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител.

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Если стоит задача выявления антител, то сделать это возможно при помощи реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В лунку с вирусом и эритроцитами закапывают различные пробы. При наличии антител они свяжут вирус, и эритроциты упадут на дно с образованием «пуговки».

Читайте также:  Диагностика фенилкетонурии у новорожденных

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса — возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

Источник

Методы диагностики вирусных инфекций.

Для диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:

2.Иммунной электронной микроскопии.

7. Использование ДНК- (РНК) — зондов.

8. Цепная полимеразная реакция.

При вирусоскопическом методев исследуемом материале обнаруживают с помощью электрон­ной микроскопии вирионы или с помощью светооптической микроскопии — внутриклеточные включе­ния. Метод электронной микроскопии дает возможность обнаружить вирионы, но он недостаточно специфичен.

Гораздо более специфичным, чувствительным и надежным является метод иммунной элект­ронной микроскопии.Он оказался особенно ценным в обнаружении тех вирусов, которые не размножаются в культуре клеток и для которых нет других тест-систем. В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сывороткой. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются микро­преципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых своеобразным «венчиком». Специфич­ность агрегации вирионов антителами позволяет надежно их идентифицировать. Разрешающая способность метода возрастает благодаря тому, что образование иммунных агрегатов повышает концентрацию вирионов в микропрепарате. Сам процесс иммунной электронной микроскопии включает следующие процедуры:

Читайте также:  Русский язык экспресс диагностика 8 класс потапова ключи

1) приготовление водного экстракта исследуемого материала и смешивание его с соответствующим объемом специфической сыворотки;

2) осаждение образующихся микропреципитатов центрифугированием;

3) негативное контрастирование иммунного преципитата фосфорно-вольфрамовой кислотой;

4) нанесение материала на сеточку;

5) просмотр препарата в электронном микроскопе.

Единственный недостаток этого метода заключается в его громоздкости, поэтому он не может быть использован для массовых исследований.

Вирусологический методоснован на выделении вирусов и их идентификации с использова­нием культур клеток или куриных эмбрионов. Для проведения вирусологического исследования важное значение имеют: выбор материала и его предварительная обработка, условия транспорти­ровки и соблюдение необходимых условий для культивирования вируса. Материал для исследо­вания определяется характером вирусного заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения. В соответствующих главах указано, при каких заболеваниях какой материал необходимо брать для выделения вируса. Для подавления возможного роста бактерий исследуемый материал обрабатывают антибиотиками, или последние добавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток в соответствующих концентрациях. Выбор способа культивирования (заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток) определяется биологией предполагаемого возбудителя. Важное значение имеет соблюдение стан­дартных условий культивирования: оптимальная температура, продолжительность, использование дополнительных тестов для индикации (бляшкообразование, реакции гемадсорбции, гемагглютинации, иммунофлуоресценции и т. д.). Для идентификации вирусов применяются типоспецифические сыворотки.

Серологические методымогут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этих целей могут быть использованы все известные серологические реакции:

1. Реакция связывания комплемента.

2. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты.

3.Реакция торможения гемагглютинации.

4.Реакция гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс антиген+ антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах).

5. Реакции преципитации в геле.

6.Реакции нейтрализации вирусов.

Читайте также:  Методика диагностики заболеваний сердечно сосудистой системы

7. Радиоиммунный метод.

8. Методы иммуноферментного анализа.

Из перечисленных методов все большей популярностью пользуются методы иммуноферментного анализа, отличающиеся высокой специфичностью и удобством использования.

Иммунофлуоресцентный метод,применяемый в прямом и обратном вариантах, является мето­дом ускоренной диагностики.

Биологический методоснован на использовании животных, чувствительных к соответствующе­му вирусу.

Метод гибридизации ДНК-ДНК, или метод ДНК-зондов— один из наиболее перспек­тивных способов исследования в современной биологии и медицине. Он может быть использован для выявления любых генов, любых фрагментов нуклеиновых кислот. В его основе лежит способ­ность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарны­ми нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется или в растворах, или, чаще всего, на твердых подложках, таких, например, как нитроцеллюлозная мембрана. Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кис­лот. После этого двухцепочечную ДНК предварительно денатурируют, а образующиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, кото­рый представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация происходит лишь в том случае, если между зондом и иммобилизованной на мембране нитью ДНК имеется гомология.

Метод цепной полимеразной реакции(ЦПР) охарактеризован выше.

Тестовые задания:

1.вирусы культивируют:

2) в курином эмбрионе

4) на тканевых культурах

5) в лабораторных животных

2.Для идентификации вирусов используют:

2) реакцию торможения гемагглютинации

3) реакцию нейтрализации цитопатического действия вирусов

4) реакцию связывания комплемента

5) реакцию пассивной гемагглютинации

3.Для индикации вирусов используют:

2) реакцию нейтрализации

3) реакцию гемагглютинации

4) реакцию торможения гемадсорбции

4.Для диагностики вирусных инфекций используют:

1) бактериологический метод

2) вирусологический метод

3) вирусоскопический метод

4) микологический метод

5) серологический метод

5.компоненты, участвуюЩИЕ в реакции торможения гемадсорбции:

2) исследуемый материал с вирусом

5) диагностическая противовирусная сыворотка

6) диагностическая антибактериальная сыворотка

6.препараты, используЕМЫЕ для специфической профилактики вирусных инфекций:

7.интерферон обладает СЛЕДУЮЩИМ действием

Источник

Adblock
detector