Меню

Fish диагностика хромосомных болезней

Fish диагностика хромосомных болезней

Подобно тому, как в ходе Саузерн-блоттинга нуклеотидные зонды используют для идентификации фрагментов ДНК, цитогенетики могут применять подобные зонды для анализа хромосомных аберраций. Для этого гибридизируют меченные флюоресцентным красителем зонды с ДНК, содержащейся в фиксированных хромосомах на предметных стеклах.

Эта техника называется Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH), поскольку ДНК, содержащаяся в интерфазном хроматине или в метафазных хромосомах, фиксирована и денатурируется на стекле в одном месте (т.е. in situ), для обработки меченым зондом, гибридизирующимся с хромосомной ДНК. Зонд флюоресцирует при освещении хромосом светом с длиной волны, возбуждающей флюоресцентный краситель. Положение гибридизационного сигнала и, таким образом, позицию сегмента ДНК с гибридизированным зондом определяют микроскопически.

Обычно для FISH-анализа используют зонды — фрагменты ДНК, имеющие уникальное положение в хромосоме. Такие зонды проходят гибридизацию и помечают место в каждой гомологичной хромосоме, соответствующее нормальному положению последовательности зонда. FISH-зонд также может быть сложной смесью ДНК, полученной из всего плеча или даже целой хромосомы. В зависимости от состава зонда, при гибридизации с ним помечается вся хромосома или ее часть.

Такие смеси зондов известны как хромосомные зонды. Наконец, можно объединить 24 различных хромосомных зонда, меченных различными комбинациями флюоресцентных красителей, испускающих свечение разной длины волны, для каждой из 24 хромосом человека. Каждая хромосома помечается зондом с собственной характерной комбинацией длин световой волны. Все 24 хромосомных зонда объединяют и используют для FISH-анализа метафазных хромосом. Эта техника известна как спектральное кариотипирование (SKY).

Поскольку каждый хромосомоспецифичный зонд имеет флюоресценцию с собственной комбинацией длин волн, мутантные хромосомы, состоящие из частей различных хромосом, при SKY-анализе хорошо различаются, а хромосомы, включенные в перестройку, могут быть легко идентифицированы. FISH, использующий единичную непрерывную последовательность нуклеотидов, хромосомоспецифические зонды и SKY-метод с комбинацией зондов для всех хромосом, широко применяют в клинической цитогенетике для обнаружения хромосомных аберраций, таких как делеции, инсерции и транслокализации.

Источник

Fish диагностика хромосомных болезней

Соматические клетки человека содержат диплоидный (2n = 46), а половые — гаплоидный (n = 23) наборы хромосом. Неполовые хромосомы (аутосомы) нумеруются по мере уменьшения их длины (от 1 до 22), а половые хромосомы указываются отдельно (X и Y).

Систематизация хромосом по парам и идентификация измененных хромосом в каждой отдельной метафазной пластинке, согласно Международной цитогенетической номенклатуре, создает кариотип клетки. Нормальный мужской кариотип — 46, XY, нормальный женский 46, XX.

Каждая хромосома разделена центромерой (перетяжкой) на два плеча: короткое, которое по международной номенклатуре обозначают латинской буквой р, и длинное — q. Терминальные участки хромосомных плеч называют теломерными.

При специальной окраске каждая хромосома приобретает индивидуальный рисунок, плечи хромосом выглядят поперечно исчерченными, в них видны светлые и темные полосы (bands) разной интенсивности. Эти полосы пронумерованы и объединены в районы (regions). Район может содержать несколько полос.

При описании любого участка хромосомы, в том числе перестроенного, используют 4 показателя:
1) номер хромосомы;
2) плечо;
3) район;
4) полоса.

Читайте также:  Диагностика посудомоечной машины bosch своими руками видео

Например, 14q32 (место локализации гена Н-цепей иммуноглобулина, область перестроек при В-клеточных лимфомах и остром лимфобластном лейкозе) — длинное плечо хромосомы 14 и вторая полоса района 3.

Различают числовые и структурные изменения кариотипа.

Пример сложной транслокации с участием трех хромосом: 10, 11 и 17

Применение FISH на интерфазных ядрах, а не на метафазных хромосомах (интерфазный анализ) позволяет за короткое время изучить сотни клеток. Метод быстро развивается, совершенствуется, количество зондов растет. В настоящее время уже многие специфические хромосомные аномалии могут быть обнаружены с помощью FISH.

Можно проводить FISH на клетках, окрашенных по Романовскому—Гимзе или в сочетании с различными цитохимическими и иммунохимическими методиками. Это создает условия для изучения гистогенеза клеток, в которых произошли изменения кариотипа.

В хорошо оборудованных лабораториях используется дорогостоящая установка для спектрального анализа хромосом SKY (multicolor spectral karyotyping), в основе SKY тоже лежит принцип FISH. Эта установка позволяет увидеть весь кариотип, причем каждая хромосома окрашивается в свой цвет.

Использование SKY дает возможность улавливать большинство транслокаций, поскольку маркеры, возникшие в результате обмена между хромосомами, окрашенными в разные цвета, состоят из разноцветных участков. Такие маркеры очень демонстративны, и при определенном опыте легко увидеть и понять, какие хромосомы приняли участие в перестройке и образовании маркеров.

Существуют опухоли и лейкозы, при которых происхождение маркерных хромосом невозможно установить без применения SKY или некоторых других модификаций FISH. Изредка возникают ситуации, когда надежную информацию о кариотипе можно получить только при сочетанном использовании перечисленных методических приемов.

Источник

Исследование гоносом FISH-методом у преимплантационных эмбрионов

Данная статья описывает исследование преимплантационных эмбрионов с помощью FISH-метода (fluorescent in situ hybridization) у супружеских пар, проходящих лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Суть исследования

Проводили определение пола у 360 эмбрионов, полученных у 42 супружеских пар в 60 циклах стимуляции суперовуляции в программе ЭКО. После биопсии и фиксации бластомеров пригодным к проведению диагностики оказалось 281 ядро, из них 217 (77,2%) не несли хромосомной патологии. 104 ядра содержали женский набор хромосом, 113 –мужской. В 64 ядрах (22,8%) были выявлены различные виды анеуплоидии гоносом. Дальнейшее развитие эмбрионов после проведения биопсии бластомера наблюдалось в 79%.

В 10 циклах стимуляции из 60 перенос не производился в связи с отсутствием эмбрионов нужного пола. Беременность наступила в 17 циклах (28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов). Из 13 клинически подтвержденных беременностей 4 прервались в 1-ом триместре, 1 –во 2-ом. 8 беременностей закончились рождением 10 (2 двойни) здоровых детей желаемого пола.

Из 64 ядер, содержащих хромосомную патологию, 19 (29,7%) имели моносомию X-хромосомы, 8 (12,5%) – моносомию Y-хромосомы. Трисомия была отмечена в 28 случаях (43,8%), полисомия в 8 (12,5%). Таким образом, полученные данные показали, что моносомия и трисомия являются наиболее частой хромосомной патологией гоносом.

Читайте также:  Бронхоэктатическая болезнь дифференциальная диагностика

Преимплантационная генетическая диагностика (ПД) возникла более 40 лет назад. Впервые R.Edwards и R.Gardner применили ее в 1967 г. для определения пола эмбрионов кролика. Уже тогда возникла идея использования данной технологии у человека для предотвращения передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако такая возможность появилась только спустя 20 лет, когда в начале 90-х годов была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять мутации в единичных клетках [2]. Впервые ПЦР для проведения ПД в клинической практике применили A.Handyside и соавторы в 1990 г., выявив специфические последовательности для Y-хромосомы при определении пола эмбрионов у супружеских пар с X-сцепленными заболеваниями. С развитием науки от проведения ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода — флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Преимущество данного метода состояло в возможности одновременного определения как X-, так и Y-хромосомы. Кроме того, стало возможным определять не только пол эмбрионов, но и выявлять анеуплоидии половых хромосом (гоносом).

На современном этапе развития медицины для определения пола преимплантационных эмбрионов используют молекулярно-цитогенетический метод FISH. Данный метод имеет ряд преимуществ перед другими способами молекулярной гибридизации: для генетического исследования методом FISH не требуется получения большого количества биологического материала, выделения ДНК из клеток, а также использования радиоизотопа P32. С помощью этого метода можно анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе в интерфазе. Его принцип основан на специфической гибридизации определенных участков хромосом с флюоресцентно-меченными зондами. Метод позволяет определить структурные перестройки хромосом и выявить число их копий в интерфазных ядрах по флюоресценции зондов.

ПД молекулярно-цитогенетическим FISH-методом с определением пола, выявлением анеуплоидии и различных транслокаций в эмбрионах занимает большую часть от общего числа проводимой диагностики в рамках программ ВРТ. В большинстве клиник основными показаниями для определения пола эмбрионов являются: наличие рецессивного Х-сцепленного заболевания, наличие делеций в Y хромосоме, а также желание родителей.

Исследуя пол у эмбрионов, все авторы отметили у них высокий уровень анеуплоидии гоносом и мозаицизм. По данным разных авторов, клеточный мозаицизм у преимплантационных эмбрионов может наблюдаться до 50% случаев. Эти исследования подтвердили, что высокая доля хромосомных нарушений, выявленная у эмбрионов, не связана с недостатками методики FISH, а соответствует истинному кариотипу исследуемых клеток. Полученные результаты указывают на то, что при проведении преимплантационной генетической диагностики супружеским парам с целью определения пола эмбрионов необходимо одновременно исследовать их на наиболее распространенные трисомии.

Цель исследования

Определение пола эмбрионов и выявление патологии в комплексе гоносом.

Материалы и методы

В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия НЦ АГиП им.академика В.И.Кулакова были проанализированы результаты проведения преимплантационной генетической диагностики (ПГД) с определением пола эмбрионов 42 супружеских пар по желанию пациентов. На момент исследования 2 пары были фертильны, остальные проходили лечение по программе ЭКО и ПЭ в связи с первичным или вторичным бесплодием. Средний возраст пациенток составил 32 года (от 23 до 43 лет). Исследование эмбрионов проводили с помощью FISH-метода.

Читайте также:  Диагностика познавательного интереса детей дошкольного возраста

Определение пола эмбриона проводили на ядрах бластомеров. Биопсия бластомера осуществлялась с помощью микроманипулятора. Для получения биологического материала прежде всего проводили пенетрацию наружной оболочки эмбриона (zona pellucida) до размера, достаточного для аспирации бластомера аспирационной микроиглой (20-40 мкм). Вскрытие zona pellucida осуществляли с помощью лазерного луча. Бластомер, содержащий четко видимое ядро, аспирировали в просвет микроиглы, соединенной с микрошприцем (50-100 мкл). Биопсированный бластомер помещали на предметное стекло, фиксировали и выполняли процесс гибридизации ДНК хромосом, содержащихся в ядре, и ДНК-зонда. Использовали зонды к X- и Y- хромосомам (фирма ABBOTT). Готовый препарат анализировали с помощью люминесцентного микроскопа (фирма Zeiss), при использовании которого каждая хромосома имеет свой, отличный от других, цвет свечения.

Результаты

Всего в 60 циклах стимуляции суперовуляции у 42 женщин было получено 520 ооцитов, после оплодотворения которых развился 371 эмбрион (71,3%). Биопсия бластомеров была проведена у 360 эмбрионов (11 эмбрионов были разрушены в ходе биопсии).

При исследовании 281 ядра, принадлежащего одноядерным бластомерам, нормальный набор по изучаемым хромосомам был определен в 217 из 281, что составило 77,2%, а в 64 отмечали различные типы анеуплоидии (22,8%). Женский набор хромосом был определен в 104 наблюдениях, мужской — в 113.

Среди выявленной патологии по изучаемым хромосомам наибольшая доля принадлежала моносомии X-хромосомы –29,7% (в 19 наблюдениях из 64). Моносомия Y-хромосомы была отмечена в 8 случаях (12,5%). Таким образом, общий уровень моносомии составил 42,2% (в 27 случаях из 64). Трисомия гоносом среди случаев выявленной анеуплоидии была отмечена в 28 наблюдениях, что составило 43,8%. Полисомия гоносом составила 12,5% (в 8 наблюдениях из 64).

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 79% случаев. Из 60 случаев проведенной диагностики отмена переноса в связи с отсутствием нужного пола была в 10 случаях. Всего беременность наступила в 17 проведенных циклах, что составило 28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов. Из 13 клинических беременностей 4 остановились в развитии в 1-ом триместре беременности, 1 прервалась во 2-ом. 8 беременностей завершились родами, родилось 10 здоровых детей нужного пола (в 2-х случаях –двойни).

Выводы

Полученные нами данные показали, что проведение ПГД FISH-методом может успешно использоваться с целью определения пола эмбрионов и дальнейшего переноса в полость матки эмбриона желаемого пола. Кроме того, определение пола FISH-методом позволяет выявить патологию гоносом, что предотвращает перенос эмбриона с хромосомной патологией в полость матки пациентки, раннюю гибель эмбриона или рождение больного ребенка. Однако, учитывая наличие мозаицизма в эмбрионе, даже после проведения ПГД рекомендована пренатальная диагностика для исключения рождения ребенка с хромосомными нарушениями.

Источник

Adblock
detector